Himedia维生素B12测定培养基 Vitamin B12 Assay Medium
货号：M036-100G
品牌：HIMEDIA
产品系列：干粉培养基
包装：100克
保存条件：
有效期：
产地：印度
维生素B12测定用培养基
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货号 |
品名 |
规格 |
储存条件 |
保质期 |
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M036 |
Vitamin B12 Assay Medium |
100G |
8°C下密闭保存，理想是放置于干燥器中。 |
使用新鲜配置的培养基。干粉见标签有效期。 |
原理
乳酸杆菌生长需要特别的营养，因而在非选择性培养基上很难生长。维生素测定用培养基用于维生素的微生物法测定。该方法需要三种培养基：即维持培养基，用于保持菌种活力；接种培养基，用于测试菌液的制备；测定用培养基，用于待测维生素的定量。
维生素B12测定用培养基，不含维生素B12，但包含所有其他维生素和必要养分，用于莱士曼乳酸杆菌（ATCC 7830）的生长。莱士曼乳酸杆菌（ATCC 7830）作为测定用菌，最早由Capp等人描述（1）并被美国药典和美国分析化学家协会（AOAC）所推荐（2，3）。
用已知稀释度的维生素B12标准品，可以制备标准曲线（2，3）。
测试菌液的制备是将将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，推荐在37°C 孵育24 小时，再离心、清洗、重悬于10 ml 生理盐水中，再通过浊度分析或酸度分析，确定生长反应。
用维生素B12的浓度及对应的吸光度制作标准曲线。用标准曲线可确定待测样本中的维生素B12的浓度。
应非常小心地避免培养基和玻璃器具的污染。应使用洁净的无去污剂的玻璃器具。少量的外源物质的污染可能导致错误的结果。
用于接种的测定菌应在专用的培养基中培养。
应用
维生素B12测定用培养基推荐采用莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830）作为测定用菌，进行维生素B12的微生物法测定。
培养基组分
成分 克/升
无维生素酸水解酪蛋白 15.000
葡萄糖 40.000
天门冬酰胺 0.200
醋酸钠 20.000
抗坏血酸 4.000
L-胱氨酸 0.400
DL-色氨酸 0.400
硫酸腺嘌呤 0.020
尿嘧啶 0.020
黄嘌呤 0.020
核黄素（维生素B2） 0.001
盐酸硫胺素 0.001
生物素 0.00001
烟酸 0.002
对氨基苯甲酸（PABA） 0.002
泛酸钙 0.001
盐酸吡哆醇 0.004
盐酸吡哆醛 0.004
盐酸吡哆胺 0.0008
叶酸 0.0002
磷酸二氢钾 1.000
磷酸氢二钾 1.000
硫酸镁 0.400
氯化钠 0.020
硫酸亚铁 0.020
硫酸锰 0.020
聚山梨酯80 2.000
盐酸鸟嘌呤 0.020
最终pH值 (25°C) 6.1±0.2
质量控制
Ø外观——奶油色至黄色，具均匀性，倾向形成可容易分解成粉末状的软块
Ø制备好的培养基颜色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有轻微沉淀
Ø配比浓度——在25°C下8.5%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值为6.1±0.2
ØpH值——5.90-6.30
配置
称取8.45g干粉培养基溶于100ml蒸馏水，必要时加热使培养基完全溶解。混匀，使轻微的沉淀均匀分布。测定时，分装试管，每管为5ml培养基（包含标准品和待测样品）。加蒸馏水，使总体积达到10ml。高压消毒15磅121°C 5分钟。立即冷却培养基。每个试管(10 ml)的维生素B12水平为0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2 ng时，均可获得满意结果。
培养反应
进行微生物法测定维生素B12。采用莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830），35-37°C孵育18-24小时。
生长状况
随着测定管标准品水平升高，（美国药典维生素B12标准水平，0，0.025,0.050，0.075,0.1,0.125,0.150,0.2ng)，目标菌生长逐渐递增，伴随着620nm处吸光度的增加。
文献
1. Capps B. E., Hobbs M. H. H. and Fox S. H., 1949, J. Biol. Chem., 178:517.
2. The United States Pharmacopoeia, 2006, USP29/NF24, The United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.
3. H. Williams, (Ed.), 2005, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 19th Ed., AOAC,Washington, D.C
微生物法测定维生素的方法学评估
在我国，微生物法测定食品中的维生素B12、叶酸、泛酸、烟酸、生物素是首选方法，因此在国民生计中起到重要作用。本文拟以维生素B12为例，从方法学的角度就微生物法的特点，作一文献上的综述。
1954年，微生物法测定乳品中的维生素B12首次出现，是由英国国立奶业研究所、维生素B12的研究专家Margaret E. Gregory首先建立，她用该法测定来自不同动物种属的奶中的维生素B12的含量（1）。
微生物法测定乳品和食品中的维生素B12，在上世纪90年代引入我国。关于这一方法，已有多篇报道进行了方法学上的探讨。现总结如下：
（一）对微生物法的评估
上海市食品药品检验所蒋孟虹等人用微生物法测定了肠内营养粉剂中的维生素B12 含量。她们认为，高效液相色谱法仅适用于常量分析,维生素B12对色谱前处理要求高, 因此色谱很难满足痕量测定的要求。但微生物法操作步骤较多, 一些因素可能影响测定结果的准确性。因此，她们对影响因素进行了研究，结果发现：
Ø测试菌液的透光率在60%～80%之间时, 标准曲线的线性拟合较好，过高过低均导致线性拟合差。
Ø当测试菌液的加入量为50μL时, 标准曲线线性拟合良好。过多易导致浊度过高而不成梯度。
Ø标准曲线最高浓度点的透光率在30%左右为佳测定时间, 此时各浓度点的透光率差别较大, 可拉开梯度。
Ø维生素B12 在0.001～0.010 ng/mL 浓度范围内线性关系良好。
她们认为，微生物法检出限低、灵敏度高,测定结果准确可靠, 适用于微量维生素B12的含量测定, 值得经常进行维生素检测的实验室应用推广（2）。
国家乳制品质量监督检验中心的张玉杰等人提出：微生物法的好处是，测定的是维生素的生物活性含量，更具生物学意义。同时，微生物作为一种活试剂，具有自身的特异性和高度的灵敏性，使得测定结果更为准确。微生物分析法测定VB12在国际上已有几十年的历史，只是在我国报导还不是很多。
他们采用微生物法对12个奶基婴幼儿食品的VB12含量进行了多次重复测定，发现相对误差均在10%以内，50%的样品测定的误差小于5%，回收率多在90-110%之间。因而该方法是可行的，结果也是准确可靠的（3）。
广东产品质量监督检验研究院林耀文等人发现，微生物法测定含乳饮料中的维生素B12，重复性良好，线性相关系数大于0.99，平均回收率为91.20%～102.2%，检出限为0.04ng/ml，具有简便、快速、灵敏度高、检出限低等优点。（5）
（二）微生物法的干扰因素和注意事项
国家乳制品质量监督检验中心的张玉杰等人提出了几点注意事项：
第一，有些细菌可以产生Vb12，因此所有玻璃器皿及用具都要严格清洗，严格灭菌。清洗后放入250℃烘箱，加热1-2小时。整个分析过程都要注意防止溶液过多地暴露于光线中。
第二，建议每个梯度标准溶液设三个平行检验管，减少误差。所有检验管灭菌后要迅速水冷却，尽量避免颜色形成。冷却速度要一样。
第三，测定菌体浓度时，要等检验管内发育和繁殖过程完全停止后再进行。（3）
湖北省宜昌市产品质量监督检验所陈绪华等人观察了测定培养基的不同品牌对维生素B12线性的影响。发现青岛海博和北京陆桥的维生素B12测定培养基作出的线性结果不理想，主要是培养基所含的本底较高。而更换为BD的测定培养基后，所得的线性结果较理想。本底存在，会导致目标物质的促生长作用减弱（即吸光度没有等量增加）。当测定培养基中不含本底时，菌悬液以及培养时间的微弱变化只影响标准曲线的生长量，不影响曲线的线性。（4）
据我们了解，目前BD的维生素B12测定培养基已停产，因此可选用国际知名的微生物生产商HiMedia的产品。
上海市质量监督检验技术研究院王志伟等人强调，菌种的活力和纯度对实验结果有非常大的影响，应严格按照要求进行菌种纯化（7）。
（三）对标准微生物法的改进
广州市质量监督检测研究院吴环等人提出了几个更简便的操作技巧用于维生素B12的测定：一是试验体系的体积缩小。用1.2ｍlPP小管替代了传统的试管进行标准曲线溶液及样品溶液的培养和测定；标准曲线溶液和样品溶液的制备也在1.2mlPP小管中进行，由此避免了大量玻璃器皿的使用，同时显著降低了外部干扰；二是将试验菌株预先固定在96排管，利用甘油保护冷冻的菌种。具体操作为：将莱士曼氏乳酸杆菌冻干菌株活化后，接种到乳酸杆菌肉汤培养基，（36.0±1.0）℃培养18～24h，将增菌肉汤培养物3000r/min离心数次，弃去上清液，使用含有甘油的维生素B12测定培养基进行适宜的稀释后，将菌悬液加入1.2ｍlPP小管中，-80℃冻存备用。该方法极大地缩短了试验周期，而且菌株活力稳定，保证了试验的有效性。（6）
吴环等人进一步将该方法推广到婴幼儿配方乳粉中的其他3种水溶性维生素（叶酸、生物素、肌醇）的测定，结果同样有效。（8）
上海市质量监督检验技术研究院王志伟等人对于天然燕麦的维生素B12的测定，加入了1%的 α-淀粉酶溶液，发现酶解溶液有助于提取维生素B12，降低样品粘度，更方便测量，因此优于现有的标准方法。
以上探讨虽然大部分是针对维生素B12,但对于采用微生物法测定的其他水溶性维生素如叶酸等也同样有效，可以借鉴。
参考文献：
1) Margaret E. Gregory. The Microbiological Assay of ‘Vitamin B12’in the Milk of Different Animal Species.British Journal of Nutrition, 1954,8(04): 340
2）蒋孟虹、许苹等. 微生物法测定肠内营养粉剂中微量维生素B12 的含量.食品安全质量检测学报. 2016,7(3):893-897
3）张玉杰、吕为群.奶基婴幼儿食品中维生素B12活性测定微生物分析法.生物技术,1993(6):39-43
4）陈绪华、刘健、江一飞. 不同测定培养基对维生素B12线性的影响. 生物技术世界. 2013(4):47
5）林耀文、佘之蕴，李姣等.微生物法测定含乳饮料中维生素B12含量. 饮料工业.2013,16(4):39-42
6）吴环、刘冬虹、张慧、聂炎炎、黄宇峰.微生物法快速检测食品中维生素B12含量的应用研究.中国乳业.2014,(4):42-44
7)王志伟、徐琼、陈欣钦、曲勤凤. 天然燕麦中维生素B12的测定中2种微生物法前处理方式的比较.食品安全质量检测学报, 2017,8(1):275-279
8）刘冬虹，吴环，聂炎炎，黄宇锋. 优化微生物法快速测定婴幼儿配方乳粉中4种水溶性维生素.华南预防医学,2014(6):594-597
维生素测定原理及注意事项
维生素是维持机体不可缺少的一类营养，虽然需要量小，但十分重要，一旦缺乏，会引发相应的维生素缺乏疾病。婴幼儿食品和乳品中含有天然的维生素，有的也有人工添加。在食品外包装上，会要求印有该食品含有哪些营养素及其含量多少（1）。我国的国家食品安全标准中，对婴幼儿食品和乳品中的维生素含量也有规定，如每 100 千卡的食品中的叶酸含量最少为 10.5 μg，最多不超过 50.2 μg（2）。之所以限定维生素的最高量，是因为维生素摄入过多，也会引发一些问题。
那么，如何来测定这些维生素的含量呢？根据国家出台的标准，不少维生素含量是采用色谱的方法来测定。有五种维生素是采用微生物法。它们是叶酸、维生素 b12、烟酸、泛酸和生物素。本文重点讲述前两种。以叶酸为例，微生物法的原理是，根据细菌对叶酸的营养需求，在一系列不含叶酸的培养基中从低到高添加已知含量的叶酸以及待测的食品样品，在 37°C 孵育 18 小时。因为有了叶酸，细菌能生长得很好，培养液发生浑浊。细菌越多，培养基就越浑浊，吸光度就越高。通过已知含量的叶酸样品的吸光度，以及待测样品的吸光度，就能确定待测样品中的叶酸含量。
测定所用的菌株均有规定。叶酸为鼠李糖乳杆菌，又称作干酪乳杆菌鼠李糖亚种（ATCC 7469）（3），维生素 b12 为莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830）（4），均可从 ATCC 等菌种库购买。维生素测定所用的培养基可以自己配，也可以购买商品化的培养基，其来源好是经过国际认证的微生物培养基生产厂家，如 HiMedia Laboratories 公司，这样质量较为可靠，其培养基组成也符合食品中叶酸和维生素 B12 测定的食品安全国家标准。
在测定中有两个非常重要的注意事项：一是由于灭菌条件，孵育温度等因素会影响标准曲线读数，并且每次该不会完全一样，因此每次测定时都应同时制备标准曲线。二、应小心避免培养基和玻璃器具遭受污染。杂菌生长会导致实验失败。同时应使用洁净的无去污剂的玻璃器具。因为任何少量的外源物质都可能导致测定结果的偏离。
测定前还需要进行菌株的培养和接种菌液的制备。接种菌液来自于储备菌种。但保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种 2-3 代以保证细菌活力。所用培养基也都有商品化的可选。
总之，微生物法测定微生物 B12 和叶酸等维生素灵敏度高，但也需要注意避免测定中可能产生的一些问题，这样才能最终把实验做好。
注释：
（1）GB 13432—2013《食品安全国家标准 预包装特殊膳食用食品标签》
（2）GB10765—2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》
（3）GB 5009 211-2014《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》
（4）GB 5413 14-2010《食品安全国家标准_婴幼儿食品和乳品中维生素 B12 的测定》