酒精液体饲料-酒精性脂肪肝造模饲料

为模拟人类酒精性脂肪肝等酒精摄入引起的相关疾病模型,在造模过程中发展出了多种的实验动物酒精摄入方案,包括酒精注射、灌胃、饮水中加入酒精、酒精液体饲料等,各有优缺点。本文主要阐述酒精液体饲料的造模方式及相关注意点。

一般,酒精性脂肪肝造模分为NIAAA急性酒精性肝损伤和酒精性脂肪肝,二者的造模方案有所区别, 这个在很多老师同学的实验方案设计中并没有考虑到,因而产生一些错误或误差。

NIAAA急性酒精肝损伤的造模方法,通常为分为,过渡期、酒精液体饲料饲喂期、高度酒精灌胃造模期,过渡期之后,持续饲喂酒精液体饲料10天,然后再饲喂酒精液体饲料的同时,持续灌胃高度白酒(酒精度52度以上)三天,剂量为5 g/kg体质量,采血,检测相关指标

NIAAA急性酒精性肝损伤模型操作流程

慢性酒精性脂肪肝,通常在过渡期之后,持续以酒精液体饲料饲喂4-6周造模,自由采食,采血、检测相关指标

酒精性脂肪肝常用测定指标有:血清ALT、AST的活性以及血清和肝脏中TG的含量,肝脏病理学检查(苏丹Ⅲ染色)、肝脏系数( % )等

关于酒精液体饲料,针对不同的应用方向,自酒精液体饲料出现后,设计出了较多的不同配方,其中使用最为广泛的是由DeCarli和Lieber在20世纪60年代首先采用的在液体饲料中加入酒精来喂养大鼠的方法而诞生的Lieber-DeCarli(LD)酒精液体饲料,另外还有基于Ain93标准调整的Ain93M及Ain93G液体饲料等。

用于建立模拟人类饮酒的动物模型的实验动物:有大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、雪貂、兔、微型猪、猴、狒狒,等等实验动物,广泛使用的是大鼠、小鼠、豚鼠等,如果是在猴、狒狒等非人灵长类动物上建模,酒精液体饲料中的酒精供能占比需要调整增高至50%以上。

经常有同学不明白酒精液体饲料的饲喂及配置方式,在此以Lieber-DeCarli(LD)液体饲料为例进行说明:

该饲料初始状态为含油粉末状饲料,根据不同的配置方式,可配置出两种液体饲料,即含酒精的酒精液体饲料组和不含酒精的对照组饲料

配置酒精液体饲料,将饲料粉末132.18g与水817.82g混合均匀后,再添加酒精50g,再次混合均匀,剩余的没有用完的,密封冷藏

对照组,132.18g饲料粉末,添加89.6g麦芽糊精,添加778.22g水,混合均匀即可

关于酒精液体饲料的饲喂:

酒精液体饲料,因为配置完成后是一种糊状的流体状态,常规的水瓶容易被堵住,所以建议采购出水口带滚珠的水瓶或者是液体饲料专用饲喂瓶,节省费用的话,可以在淘宝采购一种给宠物鸟的喂水瓶也可以使用。

关于液体饲料本身优缺点的说明:

Lieber-DeCarli(LD)液体饲料,作为最早出现、应用最为广泛的酒精性脂肪肝造模饲料,被广泛的认可,使用最多,但本款饲料本身的脂肪供能偏高,达到了35%脂肪供能,这已经属于高脂饲料范畴,如果是长期的饲喂的话,对照组本身也会产生非酒精性脂肪肝,那么,实验组的酒精性脂肪肝造模是酒精长期摄入引起的还是高脂肪引起的,数据可能存疑,因此,如果使用该液体饲料造模,建议再设定一组常规对照组,可以正常颗粒饲料或者Ain93标准液体对照饲料饲喂,作为交叉对比,增强数据可信度

Ain93标准液体饲料,该液体饲料是基于Ain93标注配置设计,脂肪供能符合正常饲料标准,营养素更为平衡,我司更为推荐以该款饲料作为实验饲料来建立酒精性脂肪肝等相关酒精摄入引起的疾病模型的建立。

其他液体饲料,液体饲料经过多年的发展,也发展出了应对各种需求的方案,例如高蛋白、高脂肪、营养素缺乏等,有具体需要可以联系我们为您提供技术支持。

过渡期饲喂说明:

鉴于酒精液体饲料,有别于常规饲料的口感及动物本身对酒精的厌恶,需要有一个过渡区间使实验动物接受酒精液体饲料,具体操作方法为,以一周七天为周期

第一天,使用不添加酒精的对照液体饲料,适应口感

第二天,液体饲料中添加1%无水乙醇

第三天,液体饲料中添加2%无水乙醇

第四天,液体饲料中添加3%无水乙醇

第五、六天,液体饲料中添加4%无水乙醇

第七天,换上正式的5%无水乙醇含量的酒精液体饲料

下方展示相关标准配方:

Diet Name 名称 单位热量值(kacl/g) Liquid AIN-93M EtOH Diet
Ain-93M液体酒精饲料
热量
Ingredient: 成分 g kcal
Casein (80 Mesh) 酪蛋白(80目) 4 38.7 154.80
L-Cystine L-胱氨酸 4 0.5 2.00
Cellulose 纤维素 0 13.8 0.00
Xanthan Gum 黄原胶 0 3 0.00
Maltose Dextrin 麦芽糖糊精 4 73.64 294.56
Sucrose 蔗糖 4 27.7 110.80
Soybean Oil 豆油(含TBHQ) 9 11.102 99.92
Mineral Mix #210052 混合矿物质 #210052 0.47 9.68 4.55
Vitamin Mix #310025 混合维生素#310025 3.8 2.77 10.53
Choline Bitartrate 酒石酸胆碱 2 0.69 1.38
95%Ethanol 95%酒精 5.35 67ml 340.53
Cold Water 蒸馏水 0 补充至1升 0.00
合计 181.582 1019.06

Ain93M标准酒精性液体饲料

Diet Name 名称 单位热量值(kacl/g) Liquid AIN-93G EtOH Diet
AIN-93G液体酒精饲料
热量
Ingredient: 成分 g kcal
Casein (80 Mesh) 酪蛋白(80目) 4 53 212
L-Cystine L-胱氨酸 4 0.8 3.2
Cellulose 纤维素 0 13.3 0
Xanthan Gum 黄原胶 0 3 0
Maltose Dextrin 麦芽糊精 4 43.3 173.2
Sucrose 蔗糖 126.5 0
Soybean Oil 豆油(含TBHQ) 9 18.604 167.436
Mineral Mix #210032 混合矿物质 #210032 0.47 9.28 4.3616
Vitamin Mix #310025 混合维生素#310025 3.8 2.65 10.07
Choline Bitartrate 酒石酸胆碱 0 0.66 0
95%Ethanol 95%酒精 5.35 67ml 340.5275
Cold Water 蒸馏水 0 补充至1升 0
合计 271.094 910.7951

Ain93G标准酒精性液体饲料  Lieber-DeCarli(LD)酒精液体饲料

L10016A To Pre-Mix L10016A # L10015 To Pre-Mix L10016A # L10016
kcal% Add kcal% Add kcal%
Protein 27 17 17
Carbohydrate 17 47 11
Fat 56 36 36
Ethanol 36
Total 100 100 100
kcal/gm 1 1
Ingredient gm kcal gm gm kcal gm gm kcal
Casein 41.4 166 41.4 166 41.4 166
DL-Methionine 0.3 1 0.3 1 0.3 1
L-Cystine 0.5 2 0.5 2 0.5 2
Matodextrin 42 25.6 102 89.6 115.2 461 25.6 102
Cellulose 10 0 10 0 10 0
Xantham Gum 3 0 3 0 3 0
Corn Oil 8.5 77 8.5 77 8.5 77
Olive Oil 28.4 256 28.4 256 28.4 256
Safflower Oil 2.7 24 2.7 24 2.7 24
Minerals – S10018 8.75 0 8.75 0 8.75 0
Vitamins – V10036 2.5 9 2.5 9 2.5 9
Choline Bitartrate 0.53 0.53 0.53
Ethanol, 100% 0 0 0 0 50 50 360
H2O 778.22 778.2 0 817.82 817.8 0
TOTAL 132.18 637 1000 996 1000 997

关于F1259液体饲料的使用说明

F1259液体饲料(粉状),经过特定方式的配比,可以得到液体饲料F1259SP(常用于对照组或者其他特殊实验需求)酒精液体饲料F1258SP(诱导酒精性脂肪肝或其他酒精性疾病)

饲喂方式为:自由采食

适应期换食的操作方法:

对照组,液体饲料F1259SP配置方式,132.83g饲料粉末+88.6g麦芽糊精(随饲料配送)+778.57g水(40℃水温最佳),充分搅拌均匀后装入饲喂瓶饲喂

酒精液体饲料换食操作:

鉴于酒精液体饲料,有别于常规饲料的口感及动物本身对酒精的厌恶,需要有一个过渡区间使实验动物接受酒精液体饲料,以一周七天为周期,具体操作方法如下:

注1:以下酒精皆为95%纯度的国药品牌酒精,酒精处于20℃左右密度为0.79,下方所有酒精质量皆经过换算,酒精的热量比值为1:7.1,即1g酒精提供7.1Kcal的热量

注2:鉴于酒精易挥发的情况,酒精液体饲料在配置时,应先将水(40℃水温)与饲料粉末充分搅拌溶解后,降低至常温,再加入相对应的酒精,做二次搅拌溶解,减少挥发

第一天,使用不添加酒精的对照液体饲料(132.83g饲料粉末+88.6g麦芽糊精(随饲料配送)+778.57g水(40℃水温最佳)),适应口感

第二天,液体饲料中添加1%无水乙醇(132.83g饲料粉末+10.5g酒精+71g麦芽糊精+785.67g水)

第三天,液体饲料中添加2%无水乙醇(132.83g饲料粉末+21g酒精+51.48g麦芽糊精+794.69g水)

第四天,液体饲料中添加3%无水乙醇(132.83g饲料粉末+31.5g酒精+32.83g麦芽糊精+802.84g水)

第五、六天,液体饲料中添加4%无水乙醇(132.83g饲料粉末+42g酒精+14.2g麦芽糊精+810.97g水)

第七天,换上正式的5%无水乙醇含量的酒精液体饲料(132.83g饲料粉末+52.63g酒精+814.54g水)

饲喂期:正式给予5%无水乙醇含量饲料,自由采食即可

其他饲喂注意事项:

  • 液体饲料需要现用现配,长期储存乙醇容易挥发
  • 务必给予实验鼠以适应期,否则很大可能出现拒食饿死的情况
  • 酒精液体饲料因为水分含量高,能量密度较低,一般每天每只小鼠采食克重会相对常规饲料要多,预计10-15g/天(考量到酒精液体饲料的适口性),一公斤F1259粉末可以配置7-8公斤液体饲料
  • 关于液体饲料分层沉淀的问题,可以在调配好饲料(乙醇不添加)后,将水温提升至40摄氏度左右,溶解一下饲料,然后恢复至常温后添加乙醇,混合混匀,饲喂
  • 液体饲料需要用专用的饲喂瓶,一种立柱式负压玻璃瓶,更好用且可以高压灭菌,适用于SPF级动物房,如果是常规环境且受限于资金,可以使用宠物鸟喂水用的塑料饲喂瓶替代

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Western Blot常见问题解析–技术篇

Western Blot常见问题解析–技术篇

1.电泳中的问题

出现问题    
︶条带呈笑脸状 l凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;电泳系统温度偏高
︵条带呈皱眉状 l可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全
拖尾 l样品溶解不好
纹理(纵向条纹) l样品中含有不溶性颗粒
条带偏斜 l电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 l加样量过多

2.  Western blot结果中背景高且不均匀

可能的原因    
抗体浓度太高 l一抗或二抗浓度太高会导致高背景,降低抗体浓度
使用的封闭液不兼容 l对比不同的封闭缓冲液
非特异性位点封闭不足 l优化封闭缓冲液,好的封闭缓冲液具有系统依赖性

l提高封闭液中蛋白的浓度

l优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜

l在封闭液中加入Tween-20,Tween-20的终浓度为0.05%

封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 l换一种不同的封闭液

l不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素

l交叉反应的检测。封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测

洗涤不充分,增加洗涤次数和使用缓冲液的体积 l降低HRP结合物的浓度

l如果洗涤液中无Tween-20,添加Tween-20使其终浓度为0.05%

膜的曝光时间过久 l缩短印迹膜曝光到胶片的时间

l按照说明书的指示,保证膜始终是湿润的

l用一张新膜

l保证膜完全被液体覆盖,避免其干燥

l在孵育过程中始终进行震荡

l小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合

l不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子

缓冲液污染或结块沉淀 l制备新的缓冲液
抗体浓度太高 l若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景,降低抗体浓度
HRP处产生聚集体 l用0.2 μm过滤器过滤结合物
结合可产生斑点 l用一种新的高质量的结合物
缓冲液中有污染 l使用新的缓冲液

l缓冲液使用前过滤

操作设备被污染 l保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物

l保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景

3.  Western blot结果中信号弱或无信号

可能的原因    
蛋白未转到膜上 l转膜结束后,用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。(注:总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。)

l确保转膜过程中胶与膜完全接触。

l确保转印夹层排布正确

l确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜

l确保转印部件在电印迹过程中未过热

l使用正对照和/或分子量Marker

l优化转印时间和电流

l确保样品制备条件优于蛋白印迹,为破坏样品的抗原性。(注意:许多蛋白不能在还原状态下进行)

蛋白未完全结合到膜上 l在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜,需使用小孔径的膜进行。
抗体不足 l增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小

l抗体可能失活,可用斑点印迹检测其活性。

抗体浓度太高 l使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失,呈现出很弱的信号。
抗原不足 l加入更多的蛋白进行跑胶

l抗原被封闭液掩蔽

l试用不同的封闭液

l优化封闭液中蛋白浓度

缓冲液中含有叠氮钠 l叠氮钠是一种HRP的抑制剂,缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂
曝光时间太短 l延长胶片的曝光时间(注意:超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时)
底物孵育时间太短 l在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。
底物失活 l超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月,超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月

l为衡量底物的活性,准备一个小量的工作液在一个暗室内,加入少量的HRP结合物,会观察到绿光。如果未检测到光,底物或HRP结合物均有可能失活

l确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降

膜可以修复剥离重新用探针检测 l在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性

l优化剥离程序

l如有必要可重新用探针检测

l避免在同一张膜上重复进行探针检测

在膜上消解抗原 l封闭底物可能含有蛋白水解酶活性(如明胶)
印迹膜保存时蛋白降解 l准备一张新的印迹膜

4.  Western blot结果中背景较高

可能的原因    
膜封闭不够 l延长封闭的时间;选择更加适合的封闭液
一抗稀释度不适宜 l对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度
一抗孵育的温度偏高 l建议4℃结合过夜
选择的膜容易产生高背景 l一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低
膜在实验过程中干过 l实验过程中要注意保持膜的湿润
检测时曝光时间过长 l减少曝光时间

5.  Western blot结果中杂带较多

可能的原因    
目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带 l查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小
目的蛋白有其它剪切本 l查阅文献或生物信息学分析可能性
样本处理过程中目的蛋白发生降解 l加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作
上样量过高,太敏感 l适当减少上样量
一抗不纯 l纯化抗体
一抗或者二抗浓度偏高 l降低抗体浓度
一抗特异性不高 l重新选择或制备高特异性的抗体

6.  Western Blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因    
检测样本不表达目的蛋白 l选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性
检测样本低表达目的蛋白 l提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂
转移不完全或过转移 l可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流
抗体不能识别测试种属的相关蛋白 l购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白
一抗孵育时间不足 l建议4℃结合过夜
二抗与一抗不匹配 l选择针对一抗来源的种属的抗体
洗膜过度 l洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20

7.  其它现象

出现现象 产生原因
膜上多处出现黑点或黑斑 l抗体与封闭试剂发生非特异性的结合
反白(条带显白色) l目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高
蛋白分子量偏低或偏高 l胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶;小分子蛋白要用高浓度胶

8.  安全问题

操作有毒试剂时,带手套和口罩,且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。