Western Blot常见问题解析–技术篇

Western Blot常见问题解析–技术篇

1.电泳中的问题

出现问题    
︶条带呈笑脸状 l凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;电泳系统温度偏高
︵条带呈皱眉状 l可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全
拖尾 l样品溶解不好
纹理(纵向条纹) l样品中含有不溶性颗粒
条带偏斜 l电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 l加样量过多

2.  Western blot结果中背景高且不均匀

可能的原因    
抗体浓度太高 l一抗或二抗浓度太高会导致高背景,降低抗体浓度
使用的封闭液不兼容 l对比不同的封闭缓冲液
非特异性位点封闭不足 l优化封闭缓冲液,最好的封闭缓冲液具有系统依赖性

l提高封闭液中蛋白的浓度

l优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜

l在封闭液中加入Tween-20,Tween-20的终浓度为0.05%

封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 l换一种不同的封闭液

l不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素

l交叉反应的检测。封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测

洗涤不充分,增加洗涤次数和使用缓冲液的体积 l降低HRP结合物的浓度

l如果洗涤液中无Tween-20,添加Tween-20使其终浓度为0.05%

膜的曝光时间过久 l缩短印迹膜曝光到胶片的时间

l按照说明书的指示,保证膜始终是湿润的

l用一张新膜

l保证膜完全被液体覆盖,避免其干燥

l在孵育过程中始终进行震荡

l小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合

l不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子

缓冲液污染或结块沉淀 l制备新的缓冲液
抗体浓度太高 l若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景,降低抗体浓度
HRP处产生聚集体 l用0.2 μm过滤器过滤结合物
结合可产生斑点 l用一种新的高质量的结合物
缓冲液中有污染 l使用新的缓冲液

l缓冲液使用前过滤

操作设备被污染 l保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物

l保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景

3.  Western blot结果中信号弱或无信号

可能的原因    
蛋白未转到膜上 l转膜结束后,用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。(注:总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。)

l确保转膜过程中胶与膜完全接触。

l确保转印夹层排布正确

l确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜

l确保转印部件在电印迹过程中未过热

l使用正对照和/或分子量Marker

l优化转印时间和电流

l确保样品制备条件优于蛋白印迹,为破坏样品的抗原性。(注意:许多蛋白不能在还原状态下进行)

蛋白未完全结合到膜上 l在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜,需使用小孔径的膜进行。
抗体不足 l增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小

l抗体可能失活,可用斑点印迹检测其活性。

抗体浓度太高 l使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失,呈现出很弱的信号。
抗原不足 l加入更多的蛋白进行跑胶

l抗原被封闭液掩蔽

l试用不同的封闭液

l优化封闭液中蛋白浓度

缓冲液中含有叠氮钠 l叠氮钠是一种HRP的抑制剂,缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂
曝光时间太短 l延长胶片的曝光时间(注意:超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时)
底物孵育时间太短 l在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。
底物失活 l超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月,超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月

l为衡量底物的活性,准备一个小量的工作液在一个暗室内,加入少量的HRP结合物,会观察到绿光。如果未检测到光,底物或HRP结合物均有可能失活

l确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降

膜可以修复剥离重新用探针检测 l在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性

l优化剥离程序

l如有必要可重新用探针检测

l避免在同一张膜上重复进行探针检测

在膜上消解抗原 l封闭底物可能含有蛋白水解酶活性(如明胶)
印迹膜保存时蛋白降解 l准备一张新的印迹膜

4.  Western blot结果中背景较高

可能的原因    
膜封闭不够 l延长封闭的时间;选择更加适合的封闭液
一抗稀释度不适宜 l对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度
一抗孵育的温度偏高 l建议4℃结合过夜
选择的膜容易产生高背景 l一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低
膜在实验过程中干过 l实验过程中要注意保持膜的湿润
检测时曝光时间过长 l减少曝光时间

5.  Western blot结果中杂带较多

可能的原因    
目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带 l查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小
目的蛋白有其它剪切本 l查阅文献或生物信息学分析可能性
样本处理过程中目的蛋白发生降解 l加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作
上样量过高,太敏感 l适当减少上样量
一抗不纯 l纯化抗体
一抗或者二抗浓度偏高 l降低抗体浓度
一抗特异性不高 l重新选择或制备高特异性的抗体

6.  Western Blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因    
检测样本不表达目的蛋白 l选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性
检测样本低表达目的蛋白 l提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂
转移不完全或过转移 l可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流
抗体不能识别测试种属的相关蛋白 l购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白
一抗孵育时间不足 l建议4℃结合过夜
二抗与一抗不匹配 l选择针对一抗来源的种属的抗体
洗膜过度 l洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20

7.  其它现象

出现现象 产生原因
膜上多处出现黑点或黑斑 l抗体与封闭试剂发生非特异性的结合
反白(条带显白色) l目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高
蛋白分子量偏低或偏高 l胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶;小分子蛋白要用高浓度胶

8.  安全问题

操作有毒试剂时,带手套和口罩,且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。