动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(单柱法)50T,常用生化试剂

动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(单柱法)50T品牌:JinPan | 货号:EK-1303-50T

产品介绍
本试剂盒可以快速地从动物细胞中提取总 RNA。其提取的总 RNA 纯度高(存在基因组 DNA),
无蛋白质及其它杂质污染,可用于 RT-PCR、qPCR、cDNA 合成、引物延伸、芯片分析、Northern Blot、
Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供

科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。

存储条件
Buffer RLT 可室温(15℃-25℃)干燥放置至少一年,加入 β-巯基乙醇的 Buffer RLT 可 4℃放置一个
月;其他试剂室温干燥保存可至少稳定 12 个月。
需要额外准备的材料
 14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为 14.3 M)
 70%乙醇:RNase-free 水配制
 无水乙醇(96%-100%)
 无 RNase 酶的 1.5ml 离心管
 无 RNase 酶的枪头
 干净的手套
 高速离心机
 物理研磨设备
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
 操作前在 Buffer RLT 中加入 β-巯基乙醇(
β-ME)至终浓度为 1%(建议现配现用),如 1 ml Buffer RLT
中加入 10μl β-巯基乙醇。配好的 Buffer RLT 可在 4℃维持稳定一个月。
 Buffer RLT 在储存时可能会形成沉淀, 如果有沉淀出现,请 37℃加热溶解后室温使用。
 Buffer RW1 作为浓缩液提供,在第一次使用前加入 0.25 倍体积的乙醇(96-100%)以获得工作溶液。
 Buffer RPE 作为浓缩液提供,在第一次使用前加入 4 倍体积的乙醇(96-100%)以获得工作溶液。
 RNase-free 水中不含任何抑菌因子,室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染,使用时尽量注意,
推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
 RNA 在 Buffer RLT 中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的无酶离心
管或玻璃器皿。
操作步骤:
1.
请根据样品种类进行以下步骤(1a 为动物细胞,1b 为动物组织)
1a. 收集动物细胞:悬浮细胞可直接 300×g 离心 5min 并仔细吸除上清留沉淀待使用;
单层贴壁细胞可通过直接裂解法(吸尽培养基留下贴壁细胞,待步骤 2 用 Buffer
RLT 裂解)或胰酶处理法(吸尽培养基留下贴壁细胞,用 PBS 清洗细胞,吸除 PBS
后使用含 0.10%-0.25%胰酶的 PBS 使细胞脱落,加入含有血清的培养基使胰酶失
活后转入 1.5ml 无酶离心管中 300×g 离心 5min,吸除上清留沉淀待使用)
注意:收集细胞数量不要超过 1×107,收集细胞时一定要将细胞培养基去除干净,否则会导致步骤 2 时细胞裂解
不完全,影响 RNA 与吸附柱的结合,导致 RNA 的产量降低。
2b. 动物组织匀浆裂解处理:
将 10mg-30mg 动物组织转移入 1.5ml 无酶离心管中并加
入 600μl Buffer RLT(动物组织量不要超过 30mg)使用前请检查 Buffer RLT 是否
加入 β-巯基乙醇,使用研磨杵或电动研磨机将动物组织彻底研磨匀浆。直接进行
步骤 3.
匀浆时间根据样本裂解难易程度决定,亦可匀浆后静置 3-5min 延长裂解时间(期间颠倒吹匀 2-3 次)。
2.
样品裂解:对于1a中使用直接裂解法的细胞应在培养皿或培养瓶中直接加入600μl
Buffer RLT(使用前请检查 Buffer RLT 是否加入 β-巯基乙醇)进行细胞裂解,之
后将裂解液全部吸入 1.5ml 无酶离心管中进行下一步操作。对于 1a 中使用胰酶处
理法的细胞应在无酶离心管中加入 600μl Buffer RLT 涡旋 1min 裂解并进行下一
步操作
若细胞量少于 5×106 可使用 350μl Buffer RLT。若细胞量较大,可涡旋后静置 3-5min 延长裂解时间(期间颠倒吹
匀 2-3 次)。
3.
将无酶离心管放入高速离心机以最大转速(~13,400×g)离心 3min。收集上清入新的
1.5ml 无酶离心管中,并加入 1 倍体积的 70%乙醇混匀。如 600μl 溶液则加入 600μl
70%乙醇。
配制 70%乙醇时请使用 RNase-free water。
4.
将步骤 3 混匀后的溶液转移入 RNase-free 吸附柱中并套上 2ml 收集管,
≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s,弃废液。
吸附柱最大上柱量为 700μl,若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于 2ml 收集管中。
5.
向吸附柱中加入 700μl Buffer RW1(使用前请确认 Buffer RW1 是否按要求加入
0.25 倍体积无水乙醇), ≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s,弃废液。
6.
向吸附柱中加入 500μl Buffer RPE(使用前请确认 Buffer RPE 是否按要求加入 4
倍体积无水乙醇),≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s,弃废液。
7.
重复步骤 6 一次。
8.
倒弃滤液,将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心 3min 干燥柱膜。
9.
将吸附柱套入新的无酶 1.5ml 离心管管中,并置于无酶的环境中开盖静置 5-10min
至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的 RNA 的下游实验造成影响。
10. 向吸附柱膜正中央加入 50-100μl RNase-free Water,盖上盖子室温静置 3-5 min。
后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心 3min 得到 RNA 溶液。
RNA 洗脱体积不应少于 30μl,否则影响洗脱效率。洗脱后的 RNA 溶液应置于-80℃储存。
RNA 纯度及浓度检测
纯度:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA,OD260/OD280 读数在 1.8-2.1
之间,比值为 2.0 是高质量 RNA 的标志。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值影响。同一
个 RNA 样品,假定在 10 mM Tris pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数 1.8-2.1 之间,在水溶液
中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间,但这并不表示 RNA 不纯。
浓度:取一定量的 RNA 提取物,用 RNase-free ddH2O 稀释 n 倍,用 RNase-free ddH2O 将分光光度计
调零,取稀释液进行 OD260, OD280 测定,按照以下公式进行 RNA 浓度的计算:
终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数 n)×40

本网站可提供的所有产品和服务均不得用于人体或动物的临床诊断或治疗,仅可用于科研等非医疗目的。