选配的试剂

蛋白酶K（20mg/ml）目录号：GF0202-01，客户自备，提取动物组织总RNA时需配备  溶菌酶（50mg/ml）目录号：GF0203-01，客户自备，提取细菌总RNA 时需配备

储存条件

DNase I溶液（DNase I 冻干粉溶解于专用保存液），储存于-20℃，可反复冻融； 其他试剂室温（15-25℃）保存。

产品简介

总RNA提取试剂盒提供了快速简单且有效的方法，可从各种动物组织、培养细胞及细菌、植物组织、   中提取总RNA。本试剂盒采用离心管柱的方式，配合使用我司独特的硫氰酸胍裂解液，使组织或细胞裂解   及均质化，并加入乙醇使RNA选择性的与管柱膜结合，于操作过程中加入DNase Ⅰ以去除残留的基因组DNA，经过多次“洗涤及离心”的步骤去除污染杂质，再以无核酸酶水回收结合在管柱膜上的RNA。若RNA     小于200nt,如5sRNA、tRNA和microRNA,无法在此系统中被有效地回收。提取的总RNA纯度高，基本没有DNA    和蛋白质污染，可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。

本试剂盒同样适用酵母，可以从酵母菌中提取总RNA,具体操作方法见“附录Ⅰ”。

本试剂盒也可用于将以其他方法提取的 RAN 进行clean up 或去除基因组DNA 污染，详见“附录Ⅱ”。

预防RNase污染，应注意以下几方面

1. 经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2. 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3. RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(V/V)，高压灭菌）。

   使用前注意事项

1. 使用前请向裂解液RL 添加 350ul 巯基乙醇，添加过巯基乙醇的裂解液 4℃保存。

2. 使用前请向漂洗液PW 添加 64ml 无水乙醇。

3. 为确保RNA 的品质及产量，应尽量收取新鲜的动物组织进行 RNA 提取，或将组织立即以液氮冷冻，储存于-70℃，组织亦可保存在RANstore 样本保存液（目录号：TR38）中。样本保存在 RNAstore 试剂中，可于37℃存放 1 天、4℃存放 1 个月、-20℃永久保存，所提取的 RNA 品质与储存在液氮中相同。

操作步骤

一、从培养细胞中提取总 RNA

1. 收集细胞

a. 悬浮细胞的收集（收集细胞数量请不要超过 1×107）：估计细胞数量，300×g 离心 5 min，将细胞收集到离心管中，仔细吸除所有培养基上清。

b. 单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过 1×107）：可直接在培养容器中裂解（容器直径不超过 10 cm），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。）

Ø 直接裂解法：确定细胞数量，彻底吸除细胞培养基上清，立即进行第 2 步裂解步骤。

Ø 胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞，吸除 PBS，向细胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的 PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-Free 的离心管中，300×g 离心 5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。

注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，影响 RNA 与吸附柱的结合， 造成RNA 的产量降低;请勿使用过多的样本量，避免管柱杜塞而造成 RNA 的产量降低。

3. 将所有溶液转移至过滤柱 CS1 上(过滤柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)离心 2min，收集滤液。 

4. 向滤液加入等体积 70%乙醇至裂解液中，混匀（此时可能会出现沉淀），转至后面“RNA 提取步骤”。 

二、从动物组织中提取总 RNA

1. 匀浆处理：

每 10-20 mg 组织加 300 μl 裂解液RL（使用前请先检查是否已加入 β-巯基乙醇），用研磨杵将组织彻底研磨（如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器）；随后向匀浆液 中加入 590 μl RNase-Free ddH2O 和

10 μl Proteinase K（20mg/ml），混匀后 56℃处理 10-20 min。

注意：组织量一定不要超过 20 mg，否则将导致RNA 得率和质量下降。

2. 将裂解混合液转移至过滤柱 CS1(过滤柱 CS1 放入收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)离心 2min，收集滤液。 

3. 向滤液加入 0.5 倍上清体积的无水乙醇，均匀（此时可能会出现沉淀），转至后面“RNA 提取步骤”。 

三、从细菌中提取总RNA

1.4℃12,000  rpm(~13,400×g)离心 2  min 收集菌体（收集菌体的最大量不超过 1×109），仔细去除所有培养基上清，以后的所有离心步骤均在室温（20-25℃）进行。

注意：如果培养基上清去除不完全，将对第二步中的细胞壁消化过程产生抑制。

2. 用含有溶菌酶的 100μl TE 缓冲液（客户自己配制，配制方法见下表）彻底重悬菌体，孵育时间见下表。  

3. 加入 350μl 裂解液 RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋振荡混匀。 

4. 将裂解混合液转移至过滤柱 CS1 上(过滤柱CS1 放入收集管)，12,000 rpm(~13,400×g)离心 2min，收集滤液。 

5. 向滤液中加入 250μl 无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），转至后面“RNA 提取步骤”。 

四、从植物组织中提取总 RNA

本试剂盒不适用于富含淀粉、酚类和次级代谢物的植物组织（例如一些木本植物，胚乳或丝状真菌的菌  丝体），因为 2-ME/裂解液在加入至样本粉末后，会变固态或非常粘稠,此类植物组织请使用“多糖多酚植物总RNA 提取kit”（货号 TR22）。 

1. 匀浆处理

50-100 mg 植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入 450 μl RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀，并于 56℃孵育 3 分钟。 

注意 1：在 56℃孵育 1-3 min 将有助于植物组织裂解，但是对于某些富含淀粉的样品，请不要加热处理， 防止因淀粉引起的样品膨胀现象。

注意 2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的 RNA 含量都不相同， 请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量。

2. 将所有溶液转移至过滤柱 CS1 上(过滤柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)离心 2-5 min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free 的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

注意：由于裂解液较粘稠，所以将溶液转移至过滤柱时，可以剪去部分吸头末端。

3. 缓慢加入 0.5 倍上清体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），转至“RNA 提取步骤”。 

u RNA 提取步骤 

此为续接样本制备“一、二、三、四、五”后的RNA 提取操作步骤。

1. 将前一步所得“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀），移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。

注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱CR1 时，如果体积大于吸附柱容量，可以分次完成。

2. 向吸附柱CR1 中加入 500ul 溶液RW，12,000 rpm (~13,400×g )离心离心 1 min，丢弃滤液，将吸附柱CR1 放回收集管中。

3. DNase Ⅰ降解。