DNA凝胶回收试剂盒250T品牌：JinPan | 货号：EK-1101-250T
从各种浓度的琼脂糖凝胶中回收70bp-100Kbp DNA片段
产品组成
产品介绍
本试剂盒采用可高效、专一结合 DNA 的硅基质材料和独特的缓冲液系统，可从各种浓度的 TAE 或
TBE 琼脂糖凝胶上回收 70bp-10kbp 大小的 DNA 片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子
及寡核苷酸引物等杂质，回收率可达 80%以上。每个离心吸附柱每次可吸附的 DNA 量为 20μg。使用本
试剂盒回收的 DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化等实验。
存储条件
该试剂盒置于室温（15-25℃）干燥条件下，可保存 12 个月，更长时间的保存可置于 2-8℃。2-8℃
保存条件下，Buffer QG 可能产生沉淀，使用前可在 55℃水浴中预热 10 min 以溶解。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌 1.5ml 离心管
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
□ 电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。
□ 如下一步实验要求较高，核酸电泳时则应尽量使用 TAE 电泳缓冲液。
□ 切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对 DNA 造成损伤。
□ 如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测 pH 值，如 pH 值大于 7.5，可向含有 DNA 的胶溶液中加
10-30µl 3M 醋酸钠（pH5.2）将 pH 值调到 5-7 之间。
□ 回收<70bp 或>10kb 的 DNA 片段时，应加大 Buffer QG 的体积，延长吸附和洗脱时间。
□ 回收率与初始 DNA 量和洗脱体积有关，初始量越少、洗脱体积越少，回收率越低。
□ 高温及潮湿等不利环境因素对吸附柱产生影响，请将吸附柱储存于阴凉干燥的环境中。
开始前试剂准备
□ 按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 Buffer PW，于室温密封保存。
□ 确认 Buffer QG 溶液显示为黄色。
DNA 浓度及纯度检测
回收得到的 DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
DNA 应在 OD260 处有显著吸收峰，OD260 值为 1 相当于大约 50μg/ml 双链 DNA、40μg/ml 单链DNA。
OD260/OD280 比值应为 1.7-2.0，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用 ddH2O 比值会偏低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
操作步骤：
1. 配制所需浓度的琼脂糖凝胶，电泳分离 DNA 片段。当 DNA 片段分离后，将凝胶置于紫外灯下，用干净锋利的手术刀快速切下含目的片段大小的 DNA 凝胶。为避免 DNA 片段受到损伤，应尽量减少凝胶的紫外照射时间，切胶时应尽量切去多余凝胶。
2. 放入 1.5ml 离心管中并称取凝胶块的重量，加入 3 倍体积的 Buffer QG（如凝胶称重结果为 100mg，则其体积约等于100µl，应加入 300µl Buffer QG）。对于>2%的琼脂糖凝胶，添加 6 倍体积的 Buffer QG。
3. 50℃水浴 10min（或直至凝胶完全溶解即可），水浴期间可颠倒混匀加速溶胶。
注意：若回收<300bp 的 DNA 片段可在完全溶胶后加入一倍凝胶体积的异丙醇以提高回收率；胶块
完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合 DNA 能力较强。
4. 凝胶完全溶解后，检查颜色是否为黄色（类似于没有溶解琼脂糖的 Buffer QG）。如果混合物的颜色为橙色或紫色，则加入 10µl 3 M 醋酸钠(pH 5.0)并混合，混合物的颜色会变成黄色。DNA 吸附到膜上仅在 pH ≤ 7.5 时有效。Buffer QG 含有一种 pH 指示剂，在 pH ≤7.5 时为黄色，在较高 pH 时为橙色或紫色，可通过颜色轻松确定 DNA 结合的最佳 pH。
5.（选做）向上述溶胶液中加入 1 倍凝胶体积的异丙醇并混合。例如，如果琼脂糖凝胶切片为 100mg，则添加 100µl 异丙醇。此步骤增加了≤500bp 和≥4 kb 的 DNA片段的产量。对于 500bp-4kb 之间的 DNA 片段，添加异丙醇对产量没有影响。
6. 将吸附柱套在 2ml 收集管中，并将上一步得到的溶液加入到吸附柱中，≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。吸附柱最大容量为 700µl，若样品体积大于 700µl，可分批加入；为提高回收率，可短暂离心用于溶胶的 1.5ml 离心管后再将溶液转移如吸附柱。
7. 向吸附柱中加入 500µl Buffer PW（已加入无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：如果回收的 DNA 是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议加入 Buffer PW后静置 2-5min 后再离心。
8. 重复操作步骤 7 一次
9. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，最大转速 (~13,400×g)离心 2min 以干燥吸附柱膜，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱套入新的1.5ml 离心管中并于室温开盖放置 5-10min 彻底晾干。注意：Buffer PW 中的乙醇残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。
10. 向吸附柱膜中央位置悬空滴加 30-50µl Buffer EB，盖上盖子室温静置 2min 后，最大转速 (~13,400×g)离心 2min 收集 DNA 溶液并置于-20℃保存。
注意：洗脱体积不应小于 30μl，体积过少影响回收效率。洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用 ddH2O 做洗脱液，并保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围内，pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。为了提高 DNA 的回收量，可重复操作步骤 10 一次。
常见问题：
1.回收效率低
凝胶未充分溶解:溶胶时，50~55℃水浴 10min，其间颠倒混匀数次，让凝胶充分溶解。
凝胶用量过多:过量的凝胶会降低回收率，切胶时尽量去除多余的凝胶。
溶胶液不足：3 倍体积的 Buffer QG 是为了保证在各种浓度的琼脂糖凝胶中都能有较好的回收率，尽量不要节省。
洗脱不充分：建议用 Buffer EB 洗脱两次，以获得最高的回收率，洗脱液必须加入柱子的膜中央。
试剂准备有误：Buffer PW 没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在 80%)。
2. 回收后出现杂带
DNA 变性：有些 DNA 片段对温度比较敏感，杂带有可能是单链的 DNA。降低溶胶温度至 37~50℃。降低温度，
可延长溶胶时间至 20~40min 让凝胶充分溶解。
3. 盐污染
A260/230 太低：Buffer QG 溶液中的异硫氰酸胍在 A230 中有较高的吸收峰。使用该产品，A260/230 通常小于 1.0。
实验表明，该产品得到的 DNA 不会影响下游的运用，包括测序，连接，定量 PCR，PCR，酶切等。
4. 连接不理想
乙醇污染：洗脱 DNA 前，打开柱子的盖子，空气干燥 10~15min 以彻底去除乙醇。
核酸变性：降低溶胶温度至 37~50℃。降低温度，可延长溶胶时间至 20~40min 让凝胶充分溶解。降低温度能有
效减少核酸的脱嘌呤和变性的影响。
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